刘耀光院士/祝钦泷研究员团队开发几乎无PAM限制的高效广靶向植物腺嘌呤碱基编辑器PhieABEs

　　近日，我校生命科学学院、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、岭南现代农业科学与技术广东省实验室刘耀光院士/祝钦泷研究员团队在国际著名学术期刊《Plant Biotechnology Journal》（IF2020=9.803，生物学一区）在线发表了题为“PhieABEs: a PAM-less/free high-efficiency adenine base editor toolbox with wide target scope in plants”的研究论文（论文链接地址：https://doi.org/10.1111/pbi.13774）。该研究利用高活性腺嘌呤脱氨酶、单链DNA结合结构域（DBD）与广靶向的SpCas9变体，成功开发了一套几乎无PAM限制的高效广靶向植物腺嘌呤碱基编辑器PhieABEs （plant high-efficiency ABEs），为植物功能基因组研究和作物遗传改良提供了实用的工具，并对其他编辑系统的改良具有参考意义。

通过将腺嘌呤或胞嘧啶脱氨酶与Cas9缺刻酶（Cas9n）融合而成的腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）和胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）能在不需要供体模板且不产生DNA双链断裂的条件下分别实现A-G（T-C）或C-T（G-A）的碱基替换。但是目前广泛使用的的ABE7.10系统在植物中的编辑效率很低（平均约为0-11.9%），而最近的研究中报道了基于新型腺嘌呤脱氨酶TadA8e开发的ABE8e系统在一定程度上提高了植物单碱基编辑效率，但仍缺乏在多个代表性靶点中对其稳定性和靶序列偏好性进行系统分析。另一方面，目前大多数碱基编辑系统使用识别NGG-PAM的SpCas9n变体，其严重限制了基因组靶点的选择自由度。因此，开发更加高效、广靶向的植物ABE系统，对促进功能基因组研究、加快农作物遗传改良进程具有重要作用与现实意义。

此外，来自人源Rad51蛋白非序列特异性的ssDNA结合结构域（DBD），对解旋后的DNA单链具有稳定作用，但其与植物ABE系统的兼容性如何，以及能否提高碱基编辑系统的活性并扩增编辑窗口，均是未知的。

刘耀光院士/祝钦泷研究员团队根据水稻密码子偏好性重新优化TadA8e、DBD的核苷酸序列，并将它们分别与两种识别NGN-PAM（PAM-less）的SpCas9n变体编码基因 SpCas9n-NG 和 SpGn ，以及一种识别NNN-PAM（PAM-free）的SpCas9n变体编码基因 SpRYn 融合，开发了一套植物腺嘌呤单碱基编辑器PhieABEs（hyABE8e-NG、hyABE8e-SpG和hyABE8e-SpRY），并在29个水稻基因组靶点（含有NGN-PAM或NHN-PAM，其中H为A，T或C）中测试分析了上述系统的编辑效率等特性。结果显示，在17个测试的NGN-PAM靶点中，PhieABEs的平均编辑效率为67.8%–78.5%，编辑窗口为A ₁ –A ₁₄ ，相较于ABE7.10（平均效率为2.6%，编辑窗口为A ₄ –A ₈ ）和普通ABE8e系统（平均效率为46.7%–59.7%，编辑窗口为A ₃ –A ₁₄ ）均有显著的提高和扩展，特别是在A ₉ –A ₁₄ 这些更靠近PAM的腺嘌呤碱基中（比普通ABE8e提高了7.98倍），且无靶序列偏好性。其中，hyABE8e-SpRY表现最为突出，在测试的靶点中（包含除上述NGN-PAM靶点外的12个NHN-PAM靶点）展现出较高的编辑活性（在7个靶点中表现出100%的编辑效率）、几乎无PAM限制的靶点识别能力、较广的编辑窗口（A ₁ –A ₁₃ ）、较低的T-DNA自靶向突变率（在NGN-PAM靶点中为16.9%，在NHN-PAM靶点中为11.9%）且不产生sgRNA依赖的脱靶效应。此外，一种进化的sgRNA（esgRNA）被用作降低SpRYn引起的T-DNA自编辑效应，但其似乎与PhieABE系统并不兼容。

该研究开发的PhieABEs编辑系统（特别是hyABE8e-SpRY）具有高效且几乎无PAM限制的靶点识别能力，为水稻和其他植物（作物）的单碱基编辑提供了更为有效实用的工具，有望能被广泛地应用于基因功能研究、基因饱和突变、引入或消除终止密码子和可变剪接等研究中。

博士后谭健韬和曾栋昌，博士生赵延昌为该论文的共同第一作者，祝钦泷研究员为通讯作者，刘耀光院士参与了相关研究工作。该研究得到了广东省基础与应用基础研究重大项目、国家自然科学基金、广东特支计划科技创新青年拔尖人才专项和中国博士后基金的资助。（文图/生命科学学院）