光学“橡皮擦”实现超分辨成像

来源: news.scnu.edu.cn

2017年10月20日，我校华南先进光电子研究院詹求强副教授课题组在Nature子刊Nature Communications报道了一种全新的光学超分辨显微成像机制: 构筑低能态电子囚阱，损耗高能态发光。

Nature Communications是仅次于Nature、Science涵盖全学科的综合性国际顶尖期刊。光学超分辨显微技术是指基于远场光学显微镜的分辨成像技术，技术原理主要有受激发射损耗显微镜技术、单分子定位显微镜技术和结构光照明显微术。在此基础上，光学超分辨显微镜的分辨率打破了光学显微镜分辨率极限，在活体样本观察、实时成像等方面具有不可替代的优势。

显微成像突破：用光“擦”出66纳米观测尺度

“在显微镜下，我们可以观察到生命中非常美的东西。”詹求强介绍道，“比如细胞分裂，我们通过用不同荧光物质标记不同成分，可在显微镜下看到它们的结构，包括细胞核、骨架和线粒体，还有相应的蛋白。”正常人体细胞大小一般在10微米级别，细胞器一般在微米甚至亚微米级别。在生命基本单元里，还有许多生命现象，发生在非常小的尺度。但由于光学“衍射极限”的存在——传统光学显微镜无法观测到尺寸小于半波长（~0.25微米）的物体，也就是说长期以来科学家们无法直接观察细胞内部发生在小于0.25微米尺度的事件，比如蛋白质分子在细胞内的相互作用和动态过程等。

虽然电子显微镜已经能观测纳米级别，但是电子显微镜样品制作复杂且通常需要真空观察环境，而在这种环境下细胞等生物样本无法存活，更不用提观测其内部物质的运动，这个问题一直困扰着科学家。

继2014年诺贝尔奖得主、德国科学家Stefan W. Hell发明了受激发射损耗显微技术（Stimulated emission depletion，STED）以来，STED技术得到了迅速的发展，极大地推动了显微成像领域的发展。STED原理是利用一束光脉冲激发聚焦光斑内所有荧光分子，再用另一束类似“甜甜圈”的空心光“熄灭”环形部分荧光，这样就可以保证在这个范围内发光的只是靠近中心的分子。利用这个方法，就可以突破“衍射极限”。然而STED技术的发展与应用仍然面临着许许多多的挑战：有机染料荧光探抗漂白性差，无法对生物样品进行长时间、实时、连续的成像；激发波长、损耗波长普遍较短，受到强烈的散射，成像深度浅。

STED技术的普及需要探寻一种能以低功率实现高损耗、无样品光漂白、激发荧光间隔大的技术方案。詹求强提出了新的思路，运用第二束光将第一束光的某些部分遮盖吸收掉，就能够得到更细更清晰的光，“这相当于用低成本的光学“橡皮擦”擦去粗线条的周边，得到更细的笔画”。詹求强课题组利用低廉的光学“橡皮擦”成功实现了高分辨率、双色STED超分辨成像，可达66纳米分辨率，与单激发光成像相比提高了约12倍。

制造“电子陷阱”， 解决光损耗难题

利用高效稀土光子学手段的低成本、低光热损伤、高信噪比、零光漂白/闪烁等优势改善传统STED技术，如何实现光控发光损耗是一个很大的难题。在此之前，没有人尝试过。针对这些科学难题与挑战，詹求强课题组多年来一直在努力寻求解决办法。

“我最早想研究这个项目可以追溯到2011年，当时还在浙大读博士。”詹求强说道，直到2012年毕业后来到华师才开始着手这方面的实验研究。“我们来的时候，这个实验室还是一个毛坯房。小到一个螺丝，大到大型激光器，实验室都是一点一滴完善的，所以我花了很长时间才把实验室建起来。”

从2013年到2015年，詹求强及其团队经过大量的失败实验后发现一个问题：世界上所有STED只利用激光和物质相互作用，利用第二束光增强第一束光，也就是物质吸收了激光的光，增强了荧光，但是并没有起到光学“橡皮擦”的作用。“如果我们不跳出这个怪圈，可能就得不到新的突破。后来我们就思考能不能在光跟物质的相互作用基础上，再引入一些其他的相互作用，比如物质之间的内部相互作用。”

詹求强课题组在2015年的工作中提出用铒的三价离子跟镱三价离子相互作用，终于摆脱了增强的魔咒，实现了30%的电子跃迁发光损耗。

2015年，课题组在国际上率先实现了有效的光控损耗上转换发光现象，实现了从负值增强到30%损耗。该原创性和突破性研究成果，为零漂白、低成本的STED超分辨提供了曙光。成果发表在国际光学著名期刊Optics Express上，开启了一个全新的子领域。

“但30%的效率对于橡皮擦功能来说还不够，距离真正实现有效的超分辨技术还有一段距离。”在此基础上，詹求强课题组在最新的论文报道中，提出在两个铥离子中制造“电子陷阱”，让电子从高能级掉下来之后被囚禁，不再返回被探测的高能级，最终他们达到近乎100%的电子跃迁发光损耗。

2017年詹求强在Nature子刊Nature Communications发表了全新的光学超分辨显微成像机制。该机制实现了不限时长、连续的STED超分辨成像，完全无光漂白、光闪烁现象，使得STED成像具有更大的时间动态范围和时间分辨率。

谈到两次突破的本质及其区别，詹求强说，第一次突破是在“光-物质作用”中率先引入“物质与物质作用”，引入两个不同离子之间的相互作用。第二次突破是两个完全相同的离子的相互作用，所以第二次的相互作用效率更高。“就好比人和人之间的语言交流会比人跟动物之间的信息交流效率高得多。”詹求强举例道。       

可运用于研究大脑、治疗癌症等

当谈及光学超分辨显微成像机制的实际应用时，詹求强表示，应用范围很广，和光学显微成像相关的领域都可以运用，特别是和生命医学和纳米科学等领域。而且该成果对STED技术和稀土光子学本身的推动都将具有深远的意义。

在全球“大脑计划”推进的过程中，光大脑可视化基本上都要借助显微荧光成像。光学超分辨显微成像机制分辨率更高，可以长时间或者不限时地观察，观察后再重构出整个大脑的网络图，极大地推动了人类认识大脑的进程。同时，在今后的细胞成像包括神经元成像领域将起到很大作用。

在生命科学方面，除了可以帮助人类认识大脑，还可以研究关注度较高的癌细胞。科学家们可以通过这种显微技术更早期且更精确地观测早期癌细胞膜上的蛋白，研究癌症机制。在发现早期癌细胞后就对它进行癌细胞治疗。癌细胞被标记之后，运用光学手段去照射它，通过光化学反应使癌细胞失活，把癌细胞杀死。

“论文发表后，我发了一条朋友圈。很多点赞，其中包括很多国内的同行研究者。还有朋友评论说：华南师大的光学果然是一流的学科。”课题组在光学超分辨显微成像机制同领域研究方面已经达到国际领先水平，詹求强也期待着能够做出更好的成绩，“我希望能做出更多更好的标志性成果，不断突破自我。同时，还想从产业化的角度把这个高效、低成本的技术进行推广。”目前国外商业化的相关科学仪器价格要800-1000万人民币，詹求强课题组有望把成本压缩至80-100万，成本下降10倍。“目前我们已经申请了5个相关专利，希望把目前这个实验室系统做成一个搬得动的小设备。”

（本文刊登于946期《华南师大报》02版）