刘耀光院士团队提出基因编辑删除基因组大片段的新策略

　　近日，我校生命科学学院、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、岭南现代农业科学与技术广东省实验室刘耀光院士团队在国际生物技术著名期刊Plant Biotechnology Journal（IF2018=6.84）在线发表了题为“Efficient CRISPR/Cas9-based plant genomic fragment deletions by microhomology-mediated end joining”的研究论文，提出了一种利用微同源介导的末端连接（microhomology-mediated end joining，MMEJ）的修复方式促进CRISPR/Cas9的植物基因组大片段删除新策略。（论文链接地址： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13390 ）。

　　CRISPR/Cas9系统进行基因组切割导致DNA双链断裂，常通过NHEJ修复方式，在靶位点处产生一个或几个碱基的插入或缺失，以达到基因敲除的目的。然而这一类突变往往会使基因产生不正常的转录本或蛋白。因此对目标基因进行大片段删除将有助于真正实现编码或非编码基因的功能研究。通过对已有水稻基因编辑群体（靶点设计未事先考虑微同源序列（microhomologous sequences，MHSs））的基因组片段删除大小的分析，发现MMEJ的修复方式比非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复方式，能更有效的促进植物基因组大片段的删除。为了验证这一发现，作者选择了一个单位点插入的转基因水稻材料中的潮霉素抗性基因（HPT）表达盒作为删除目标，利用其开发的在线微同源搜索程序RepFinder ( http://skl.scau.edu.cn/repfinder/ ) 找到HPT表达盒两侧的5-7 个碱基的MHSs；再利用其开发的基因组编辑综合在线工具CRISPR-GE ( http://skl.scau.edu.cn/ )设计尽量靠近MHSs的编辑靶点。通过构建多基因编辑载体并再转化上述转基因水稻，最终在T0代编辑植株中，获得了66.7%的HPT表达盒删除的植株,其中预期的MMEJ介导的删除效率高达52.4%，而NHEJ介导的删除效率仅为14.3%。 进一步分析发现影响MMEJ介导CRISPR/Cas9基因组大片段删除效率主要有三个方面：(1)切割位点距离MHS较近将有助于片段删除；(2)MHS的长度对MMEJ介导基因组片段删除效率的影响并不显著；(3)使用多个靶点同时产生多个DNA双链断裂可能会增加基因组片段缺失的频率。上述研究为植物功能基因组学的发展和作物遗传改良的应用，提供了有力的研究工具。

　　论文的第一作者为博士后谭健韬，论文的通讯作者为刘耀光院士和祝钦泷青年教授。该研究得到了广东省基础与应用基础研究重大项目、国家自然科学基金项目和广东特支计划科技创新青年拔尖人才专项的资助。 （文图/ 生命科学学院 赵秀彩）